小核酸藥物定義、分類、優(yōu)勢、壁壘及技術(shù)難點在哪？

小核酸藥物靶標(biāo)豐富、藥效持久、研發(fā)效率高。

小核酸藥物定義：小核酸藥物是由幾十個核苷酸串聯(lián)而成的短鏈核酸，按作用機(jī)制可分為兩類： 以RNA為靶點、通過促進(jìn)或抑制翻譯來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，包括ASO （反義寡核苷酸）、siRNA（小干擾 RNA）、miRNA (微小RNA)、 saRNA（小激活RNA）等； 以蛋白質(zhì)為靶點的Aptamer (適配體)，可特異性結(jié)合靶蛋白，起到類 似抗體的功能。 作用機(jī)制：RNA療法的作用機(jī)制與傳統(tǒng)的小分子或蛋白類藥物非常不同， 其作用靶點是RNA，作用方式是通過堿基互補(bǔ)配對與mRNA結(jié)合，并調(diào)控 其表達(dá)和剪接，或者模擬內(nèi)源的mRNA，翻譯產(chǎn)生有功能的蛋白。

小核酸藥物分類： 1. ASO（反義寡核苷酸）：進(jìn)入細(xì)胞后靶向mRNA，通過阻斷RNA的功能來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。兩種常用的作用模式：A) 核糖核酸酶 H1（RNase H1）介導(dǎo)的靶標(biāo) mRNA 降解；B) 靶標(biāo) mRNA 調(diào)節(jié)（通過剪接轉(zhuǎn)換/空間阻斷）。 2. siRNA（小干擾 RNA）：能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的Argonaute 2蛋白（AGO2），與Dicer和TRBP組裝成為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），與靶mRNA結(jié)合并切割斷 裂，降解后導(dǎo)致靶基因下調(diào)。 3. miRNA (微小RNA)：與siRNA相似，初級pri-miRNA與Dicer和AGO形成miRISC復(fù)合體，結(jié)合mRNA降解，形成空間位阻抑制翻譯。 4. saRNA（小激活RNA）：招募RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體（RITA complex，包括AGO2、CTR9、RHA和RNAPⅡ）刺激靶基因轉(zhuǎn)錄的啟動和延伸。 5. RNA適配體（Aptamer）：有三維結(jié)構(gòu)，能夠直接和蛋白質(zhì)，小分子等結(jié)合產(chǎn)生作用。

核酸藥物優(yōu)勢：提供了更廣泛的候選靶點，并且具有更短的開發(fā)周期、更好 的靶向性和特異性、更持久的藥效、更廣泛的治療領(lǐng)域應(yīng)用等，有望成為繼小 分子、抗體藥物后的第三大藥物類型。 1. 靶標(biāo)可及性廣。在人類基因組編碼蛋白質(zhì)中，只有約1.5%（對應(yīng)約2萬個蛋白質(zhì)）能 成藥，其中只有約10%-15%與疾病相關(guān)（占比0.2%，對應(yīng)約2000-3000個蛋白質(zhì)）。 當(dāng)前，已獲批藥物僅能對不到700種人類基因組編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)生治療作用（占比 0.05%）。理論上，RNA擁有靶向人類基因組中所有致病基因的潛力，其潛在靶點 涵蓋與未成藥或難成藥蛋白質(zhì)相關(guān)的mRNA（占比0.15%）以及非編碼RNA（占比 70%）。

2. 靶向性/特異性強(qiáng)。小核酸藥物可高精度、特異性靶向致病基因的mRNA，從上游調(diào) 控其表達(dá)并在單堿基水平實現(xiàn)序列特異性，最大限度減少非疾病相關(guān)基因或細(xì)胞過 程的脫靶效應(yīng)。而更強(qiáng)的靶向性和特異性恰恰是小核酸藥物在療效和安全性方面的 核心優(yōu)勢，因此有望開發(fā)出選擇性更高、療效更佳、副作用更小的療法。 3. 研發(fā)效率高。由于需要與復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相匹配，而蛋白質(zhì)在體內(nèi)可能發(fā)生構(gòu)象 變化，故小分子藥物早期開發(fā)和篩選復(fù)雜，其先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)具備高度偶然性，且 分子優(yōu)化需要大量篩選工作。抗體藥物篩選因為涉及動物免疫和人源化等步驟，制 備周期較長、批次間差異大。 4. 給藥間隔長。小核酸藥物一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并結(jié)合靶mRNA，能夠觸發(fā)RNA降解或翻 譯阻斷，在靶基因被沉默后，生物體需要時間合成新的mRNA或蛋白質(zhì)恢復(fù)功能， 這種細(xì)胞基因表達(dá)的自然周期使得小核酸藥物的作用時間相對更長，其藥效通常可 以持續(xù)數(shù)月甚至1年，而長效療法能顯著提升慢病患者依從性，打開潛在臨床需求。

小核酸藥物設(shè)計壁壘 –化學(xué)修飾：針對小核酸容易被吸收代謝，酶解，造成免疫應(yīng)答，且難以通過細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等，可以通過化學(xué)修飾提高小核酸藥物的親和力、穩(wěn)定 性、代謝性質(zhì)等。常見的主要是骨架修飾的硫代磷酸酯（PS）， 2‘位置的核糖環(huán)修飾，甲基，甲氧基乙基和-氟等。

ASO作為單鏈核酸分子，分子量小，可以通過自遞送細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞并直接與mRNA結(jié)合，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾后在人體內(nèi)不易被核酸內(nèi)切酶等物 質(zhì)降解失效。因此主要依靠化學(xué)修飾而非遞送系統(tǒng)，在多種器官中成藥性較好。

小核酸藥物設(shè)計壁壘 – 遞送系統(tǒng) – GalNAc機(jī)理：它與肝細(xì)胞表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）特異性結(jié)合，實現(xiàn)細(xì)胞快速胞吞。GalNAc是直接共 價結(jié)合偶聯(lián)在小核酸末端的生物綴合物遞送，酸敏感的linker可使核酸偶聯(lián)物在通過內(nèi)吞體進(jìn)入細(xì)胞后脫離。

優(yōu)勢： (1)高效的肝細(xì)胞靶向性：在治療肝臟相關(guān)疾病時，使將治療藥物準(zhǔn)確地遞送至肝細(xì)胞發(fā)揮作用，減少 藥物在其他非靶器官的分布，從而降低藥物對正常組織可能產(chǎn)生的副作用。(2)化學(xué)修飾靈活性：GaINAc分子 本身具有多個可以進(jìn)行化學(xué)修飾的位點。可以通過化學(xué)鍵連接不同類型的藥物分子。這種靈活性使得它能夠適 配多種治療藥物的遞送需求。(3)良好的體內(nèi)穩(wěn)定性：當(dāng)藥物與 GaINAc形成遞送復(fù)合物后，它能夠保護(hù)藥物分 子免受血液中各種酶和蛋白質(zhì)的降解，有助于藥物在到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞之前能夠維持其完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性， 確保后期藥物有效地發(fā)揮其治療作用。(4)相對較低的免疫原性：GaINAc是一種生物體內(nèi)天然存在的糖類分子， 與人體自身的成分具有一定的相似性。人體免疫系統(tǒng)對其識別為外來異物的概率相對較低，不容易引發(fā)強(qiáng)烈的 免疫反應(yīng)。

局限性：對mRNA之類較大核酸無能為力，也只能靶向肝。應(yīng)用：Alnylam對GalNAc專利覆蓋較為全面，包括雙鏈核酸結(jié)構(gòu)、限定位點修飾、GaINAc靶頭、連接臂、 GaINAc-寡核首酸偶聯(lián)物等。基于GalNAc 的技術(shù)平臺還有Dicerna的GalXC、Arrowhead的TRiM、Ionis的 LICA等。

肝外遞送比如AOC。其他遞送系統(tǒng)： ? AOC（抗體偶聯(lián)寡核苷酸） ? 優(yōu)勢：（1）肝外靶向。（2）AOC藥物偶聯(lián)可選方式較多： 離子相互作用、基于親和素/鏈霉親和素、基于蛋白A/蛋 白G偶聯(lián)、核酸雙鏈雜交結(jié)合等偶聯(lián)技術(shù)等。 ? 應(yīng)用：主要有Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics、 Tallac Therapeutics、Denali Therapeutics等。 ? 相較ADC制備差異：（1）核酸分子量可大于10kDa，而 小分子通常小于2kDa，分析和純化方法或許不適用。（2） 核酸磷酸骨架帶負(fù)電荷，是水溶性，傳統(tǒng)ADC通常是中性 的或具有少于兩個電荷/藥物連接劑。（3）如何測定藥物 抗體比率OAR，DAR值依賴于藥物連接劑的疏水性。

小核酸合成：目前主要采用成熟的固相合成技術(shù)，（1）自動化程度高。（2）反應(yīng)流程簡便高效且產(chǎn)物質(zhì)量有保障，可達(dá)約50%的產(chǎn)率和90%的純度。（3）該過程較為靈 活，能夠進(jìn)行核酸衍生物規(guī)模產(chǎn)生，比如經(jīng)修飾的單鏈和雙鏈寡核苷酸、適體和偶聯(lián)物。（4）規(guī)模可以很輕松地從克級擴(kuò)大到數(shù)公斤級，以進(jìn)行臨床和商業(yè)化應(yīng)用。 ? 壁壘：工藝開發(fā)、放大和質(zhì)量控制存在高壁壘，難度高于一般小分子API。前期投入包括小核酸原料藥固相合成設(shè)備，潔凈環(huán)境，GMP要求等。 ? 局限性：固相載體樹脂成本高昂，化學(xué)試劑昂貴（起始原料）消耗量較大（有機(jī)溶劑），以及放大生產(chǎn)難度較高。 ? 未來發(fā)展：隨著液相合成新技術(shù)的發(fā)展（單批次產(chǎn)量可達(dá)數(shù)十公斤），液相合成有望成為未來大規(guī)模生產(chǎn)的主流選擇。

小核酸的創(chuàng)新與科研轉(zhuǎn)化依舊存在技術(shù)難點 ? 穩(wěn)定性問題：如何進(jìn)一步優(yōu)化修飾策略，提高藥物的穩(wěn)定性和成藥性，仍是當(dāng)前研發(fā)的重點和難點。 ? 內(nèi)體逃逸瓶頸：內(nèi)體的脂質(zhì)雙層可以捕獲并保留大約99%的RNA分子，導(dǎo)致藥物無法到達(dá)目標(biāo)RNA，從而降低治療效果并增加毒性。 ? 器官組織特異性：目前主流的GalNAc遞送系統(tǒng)只能實現(xiàn)肝臟精準(zhǔn)靶向遞，肝外遞送策略仍在探索。 ? 工藝開發(fā)壁壘：擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)中，原材料和設(shè)備的質(zhì)量、速度和成本等，生產(chǎn)技術(shù)的純度、通量、自動化程度、速度、GMP生產(chǎn)等要求。 ? 不良反應(yīng)和毒性問題：存在肝損傷、過敏等不良反應(yīng)，與藥物組織靶向性差、非靶標(biāo)結(jié)合及遞送成分毒性有關(guān)。