蝦青素的合成步驟有哪幾步？

在《金城醫(yī)藥（300233）研究報(bào)告：醫(yī)化平臺(tái)穩(wěn)步發(fā)展，合成生物平臺(tái)迎新機(jī)》報(bào)告中，對(duì)蝦青素的合成步驟進(jìn)行了詳細(xì)的研究分析，如果需要更多相關(guān)信息，請下載原報(bào)告。

1.獲取 CrtW 基因和 CrtZ 基因

β-胡蘿卜素酮化酶和β-胡蘿卜素羥化酶可以將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為 終產(chǎn)物 3S-3’S（左旋）型蝦青素。合成上述兩種酶的基因可以從天然 生產(chǎn)蝦青素的藻類和細(xì)菌中獲取。經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增、純化以及根據(jù)耶氏 酵母菌的密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化等步驟后，CrtW 和 CrtZ 基因可進(jìn)入 下一步的整合階段。 

2.利用 CRISPR/Cas9 操作系統(tǒng)進(jìn)行基因定點(diǎn)整合

該步驟將 CrtW 和 CrtZ 基因用 CRISPR/Cas9 操作系統(tǒng)或隨機(jī)整合方法 分開或串聯(lián)插入到 XK17、IF015、YC607 這三株高產(chǎn)β-胡蘿卜素的解 脂耶氏酵母工程菌株的基因組特定位點(diǎn)。CRISPR/Cas9 操作系統(tǒng)可將無 標(biāo)記基因靶向整合到解脂耶氏酵母基因組的特定位置。該系統(tǒng)將單鏈 導(dǎo)向 RNA（sgRNA）與 RNA 聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）-tRNA 雜合啟動(dòng)子相結(jié) 合，構(gòu)建用于基因敲除和整合的 CRISPR-Cas9 表達(dá)質(zhì)粒 pCRISPRyl。另 一方面，在解脂耶氏酵母模式菌 Polf 基因組上篩選出多個(gè)基因整合效 率較高的位點(diǎn)，構(gòu)建了帶有 hrGFP 表達(dá)盒的同源供體質(zhì)粒 HR Donor。 最終，通過共轉(zhuǎn)化 pCRISPRyl 和重組 HR Donor 實(shí)現(xiàn)目的基因的整合。

3.通過隨機(jī)整合的方法整合目的基因

由于解脂耶氏酵母菌能夠高效吸收外源 DNA 片段，也可將七種 CrtW 基因和十種 CrtZ 基因以下圖的構(gòu)建方式隨機(jī)整合到解脂耶氏酵母的 基因組上。

4.篩選高產(chǎn)菌種

通過搖瓶發(fā)酵并測定不同工程菌株的蝦青素產(chǎn)量，得到高產(chǎn)候選菌種。 最終，以 IF015 為出發(fā)菌株，先后定點(diǎn)插入 CrtZ(A08 位點(diǎn))、CrtW（XPR2 位點(diǎn)）的產(chǎn)蝦青素重組菌 ECA-1 為最優(yōu)菌種，搖瓶水平的蝦青素產(chǎn)量 可達(dá) 30-40mg/L。

5.發(fā)酵制備蝦青素

ECA-1 菌株在特定的發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境下產(chǎn)出蝦青素，實(shí)驗(yàn)中最高可達(dá) 1.0g/L，且蝦青素占類胡蘿卜素比例很高，為全左旋的蝦青素。